TEMA 7: PRODUCCION INDUSTRIAL DE METABOLITOS PRIMARIOS


Dr. Pedro F. Mateos González



I. METABOLITOS PRIMARIOS DE INTERES INDUSTRIAL


Los metabolitos primarios son moléculas de bajo peso molecular que intervienen, bien como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas anabólicas y catabólicas. Los más importantes desde el punto de vista industrial son los aminoácidos, nucleótidos, vitaminas, ácidos orgánicos y alcoholes.

· Alcoholes: etanol


· Aminoácidos: ácido glutámico, lisina, treonina


· Nucleótidos: ácido 5' guanílico, ácido 5' inosínico


· Acidos orgánicos: ácido acético, ácido propiónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido glucónico


· Polioles: glicerol, manitol


· Polisacáridos: xantano


· Azúcares: fructosa, sorbosa


· Vitaminas: riboflavina (B2), cianocobalamina (B12)


Como ya hemos dicho, la superproducción de metabolitos primarios es evitada por la mayoría de los microorganismos, puesto que son procesos que consumen gran cantidad de energía, lo cual hace que sean menos competitivos en los ambientes naturales. Sin embargo, existen en la Naturaleza microorganismos que tienen alterados sus sistemas regulatorios y éstos son precisamente los que a lo largo del proceso de búsqueda son seleccionados para su utilización en microbiología industrial. Estos cultivos posteriormente se someten a un profundo estudio mediante el cual, alterando las condiciones del medio y/o por modificaciones genéticas, incrementamos la superproducción del producto que nos interesa.

Mediante estas alteraciones se ha conseguido, por ejemplo, que la bacteria Pseudomonas denitrificans produzca 50.000 veces más vitamina B12. Las manipulaciones más frecuentes son la
alteración de la regulación por retroalimentación y la alteración de la permeabilidad.


II. ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION


La regulación por retroalimentación es el control que utilizan los microorganismos para evitar la superproducción de aminoácidos y nucleótidos. Para eliminar este control se han empleado dos tipos de manipulaciones: alteración de la acumulación de productos finales y obtención de mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación.


1.- Alteración de la acumulación de productos finales



A. Evitar la acumulación de productos finales

En una
ruta metabólica sencilla (no ramificada) la limitación de la capacidad de la célula para acumular intracelularmente productos finales inhibidores o represores, se utiliza generalmente para la superproducción de algún intermediario de esta ruta metabólica. En el siguiente esquema se representa este principio:

Si nosotros deseamos obtener una superproducción del producto intermediario C en una ruta metabólica sencilla donde el producto final E por retroalimentación inhibe al enzima a y reprime a los enzimas a y b, lo primero que se hace es obtener un mutante auxótrofo que le falte el enzima c. Al no poder sintetizar el producto E, este mutante requiere para su crecimiento que se añada en el medio E. Si se añaden bajos niveles de E, los necesarios para que el microorganismo crezca, éste microorganismo no podrá acumular concentraciones de E que inhiban o repriman a los enzimas a y b con lo que será posible obtener una gran acumulación de C.

Mediante este tipo de manipulación se ha conseguido por ejemplo, que un mutante de Corynebacterium glutamicum auxótrofo en Arginina produzca 26 gramos/litro de
L-Ornitina.

B. Acumulación de productos finales

Se utiliza en
rutas metabólicas ramificadas. Consideremos una ruta metabólica ramificada que conduce a dos productos finales, A y B. Con frecuencia, si conseguimos disminuir la concentración de B, el producto A se acumularía.

El ejemplo más importante, con interés comercial, de la utilización de esta estrategia es la superproducción de
lisina. Este aminoácido se utiliza como aditivo nutritivo, puesto que la mayoría de las proteínas de cereales son deficientes en este aminoácido. Pertenece a la familia del aspartato y se produce en la mayoría de las bacterias en una ruta metabólica ramificada que produce además metionina, treonina e isoleucina.

En Escherichia coli, el primer paso de esta ruta está regido por tres aspartato quinasas, cada una de las cuales está regulada por un producto final diferente y, además, cada producto final regula el primer enzima después de cada ramificación.

Sin embargo, en los microorganismos utilizados en la fermentación para la producción de lisina (Corynebacterium glutamicum) existe una única aspartato quinasa regulada por un mecanismo concertado de retroalimentación por la treonina y lisina. Así mismo, tampoco poseen regulación en la ramificación.

Mediante la eliminación genética del enzima homoserina deshidrogenasa, se obtiene un mutante que no puede crecer salvo que se añada en el medio metionina y treonina. Mientras que los niveles de treonina que se añadan sean bajos, pero suficientes para el crecimiento del microorganismo, no se producirá una inhibición por retroalimentación de la aspartato quinasa, con lo que estos microorganismos son capaces de producir 50 gramos de L-lisina por litro.

2.- Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación

Una segunda vía para eliminar la regulación por retroalimentación y así obtener una superproducción de metabolitos primarios es alterando la estructura del enzima sujeto a la inhibición o modificando los genes reguladores de tal manera que el sistema no sea reprimible.

El sistema más sencillo para aislar estos mutantes es seleccionar las cepas resistentes a los efectos tóxicos que produce un análogo del compuesto que nos interesa. Para ello se someten a mutación los microorganismos y, posteriormente se siembran en placa en presencia del análogo. Aquellas cepas que son capaces de crecer y formar colonias son las que se seleccionan. Algunos de estos mutantes resistentes serán superproductores del metabolito que nos interesa.

D'

A --------> B --------> C -------->D


Si el análogo D' inhibe la síntesis de D, el microorganismo no puede producir este metabolito y muere. Por el contrario, si D' no inhibe la síntesis de D, el microorganismo seguirá produciendo D y sobrevivirá. En este caso puede haber ocurrido una alteración en la estructura del enzima, con lo que obtenemos mutantes resistentes a la inhibición por retroalimentación. O bien, puede haber ocurrido una alteración en el sistema de síntesis del enzima, con lo que obtenemos mutantes resistentes a la represión por retroalimentación. En cualquier caso y debido a la alteración de estos controles, el microorganismo superproduce D.



III. ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD


El incremento de la permeabilidad de la membrana citoplasmática es el responsable de la superproducción de ácido glutámico, que es con diferencia el aminoácido más importante de los producidos por fermentación. Se utiliza en forma de glutamato monosódico como potenciador de aromas.

Todos los microorganismos superproductores de glutamato tienen dos características comunes:

(i) Una deficiencia en el enzima a-cetoglutarato deshidrogenasa.


(ii)
Requerimiento nutricional de biotina.



La deficiencia del enzima del ciclo de Krebs canaliza el metabolismo del carbono hacia glutamato; mientras que la deficiencia en el bloque biosintético de la biotina da lugar a una alteración de la permeabilidad de la membrana lo que permite la excreción del glutamato producido.

La principal ruta en la producción de glutamato a partir de glucosa es la ruta de Embden-Meyerhof y los primeros pasos del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. El
a-cetoglutarato, el cual normalmente se convierte en succinil CoA en el ciclo, es aminado por acción de la glutamato deshidrogenasa y se transforma en glutamato debido a la deficiencia en la a-cetoglutarato deshidrogenasa. De esta manera se pueden llegar a conseguir 100 gramos por litro de glutamato.

Durante el crecimiento con glucosa, los microorganismos superproductores acumulan intracelularmente glutamato, hasta que la célula es saturada (c.a. 50 mg/g de peso seco). Entonces, y por medio de la regulación por retroalimentación, se bloquea la síntesis de glutamato salvo que se modifique la permeabilidad y así se facilite la salida del aminoácido al exterior de la célula. Esta modificación de la permeabilidad se consigue mediante una deficiencia en el bloque biosintético de la biotina. Una deficiencia en biotina origina cambios en la composición lipídica de la membrana debido al papel que desempeña la biotina en la síntesis de ácidos grasos. Los niveles de biotina que se deben añadir al medio son críticos a la hora de obtener una buena producción de glutamato. Las concentraciones que se usan están entre 1 y 5 µg/L de biotina. Una concentración de 15 µg/L elimina la excreción de glutamato, con lo que se acumularía en la célula.

Esta modificación de la permeabilidad también se puede alterar añadiendo penicilina durante la fase logarítmica de crecimiento. Aunque la penicilina no inhibe la síntesis de fosfolípidos, su adición resulta en una inmediata excreción de fosfolípidos. Otra forma de alterar la permeabilidad de la membrana es añadiendo detergentes.