TEMA 10: RECOMBINACION GENETICA

Dr. Pedro F. Mateos González



I. OBJETIVOS


La recombinación genética es un proceso que lleva a la obtención de un nuevo genotipo a través del intercambio de material genético entre secuencias homólogas de DNA de dos orígenes diferentes. La información genética de dos genotipos puede ser agrupada en un nuevo genotipo mediante recombinación genética. Por lo tanto la recombinación genética es otra forma efectiva de aumentar la variabilidad genética de una población.

Las ventajas de la recombinación genética son:

(i) Diferentes cepas superproductoras pueden ser reunidas en una sola cepa, de forma que el efecto acumulativo de estas mutaciones puede ser mayor que el efecto de una sola mutación. Sin embargo, la esperanza inicial de obtener un aumento significativo en el rendimiento por simple recombinación de dos mutantes de alta producción sólo ha sido conseguida en unos pocos casos. En la mayoría de los casos, la productividad de los recombinantes generalmente es intermedia entre los valores de las cepas parentales.

(ii) En el curso del desarrollo de cepas existe frecuentemente un descenso en el aumento del rendimiento después de cada etapa de mutación. Además de los mutantes que son enriquecidos selectivamente debido a su aumento en la productividad, existe un desarrollo de mutaciones que no se detectan que impiden un aumento adicional en la producción de metabolitos a través de influencias pleiotrópicas. Con cruces genéticos, estos alelos mutantes desfavorables pueden ser reemplazados por alelos de uno de los padres del cruce.

(iii) Las cepas de alta producción pueden realmente aumentar el coste de la fermentación debido al cambio de las propiedades fisiológicas (mayor producción de espuma, cambio en los requerimientos del medio de cultivo, etc.). Cruzando de nuevo la cepa con la cepa silvestre pueden obtenerse cepas de alta producción con propiedades mejoradas de fermentación.




II. RECOMBINACION GENETICA


Como ya hemos dicho, la recombinación genética es un proceso que lleva a la obtención de un nuevo genotipo a través del intercambio de material genético entre secuencias homólogas de DNA de dos orígenes diferentes. Las secuencias homólogas de DNA tienen la misma secuencia o casi la misma; por consiguiente, puede ocurrir apareamiento de bases en una longitud extensa de las dos moléculas de DNA. Los cromosomas homólogos tienen los mismos genes ubicados en el mismo sitio. Sin embargo, los genes, aunque similares, pueden no ser necesariamente idénticos como ocurre cuando existe una mutación en un gen.

Para que aparezcan nuevos genotipos como consecuencia de la recombinación, es esencial que las dos secuencias homólogas sean genéticamente diferentes. Tal es el caso en una
célula eucariótica diploide, que tiene dos juegos de cromosomas, uno procedente de cada padre. El punto donde los cromosomas se cruzan se denomina kiasma y el proceso de intercambio se llama entrecruzamiento.

En las células procariotas sólo existe un único cromosoma. Por lo tanto, antes de que pueda ocurrir la recombinación, un cromosoma homólogo (normalmente una parte de este) debe primero ser transferido desde una bacteria donadora a una bacteria receptora. Debido a que el cromosoma del donador debe ser homólogo con el receptor, las bacterias donadoras y receptoras generalmente pertenecen a la misma especie o a especies muy relacionadas.

La recombinación homóloga ocurre después de la transferencia es decir, cuando el fragmento de DNA del donador está en la célula receptora. Si no se produce recombinación, el fragmento de DNA del donador se perderá, debido a que no puede replicarse independientemente.




III. RECOMBINACION GENETICA EN BACTERIAS


La recombinación genética en bacterias tiene lugar cuando se transfieren fragmentos de DNA homólogo desde una célula donadora a una célula receptora por uno de estos tres procesos:

1.- Transformación: supone que el DNA donador se encuentra libre en el medio.


2.- Transducción: donde la transferencia del DNA donador está mediada por un virus.


3.- Conjugación: donde la transferencia implica un contacto célula-célula y la presencia de un plásmido conjugativo en la célula donadora.




IV. RECOMBINACION GENETICA EN HONGOS


Los hongos tienen dos tipos distintos de procesos de recombinación genética que pueden ser utilizados en un programa de mejora de cepas. Son conocidos como ciclos sexual y parasexual.

A.- Recombinación sexual

Algunos hongos utilizados industrialmente (Aspergillus, Claviceps, Saccharomyces) tienen un ciclo sexual completo. En estos organismos la fusión nuclear (
cariogamia) conduce a la mezcla de núcleos en el organismo diploide. Después de la formación de diploides tiene lugar la recombinación durante el proceso subsecuente de meiosis. Se produce un nuevo genotipo, bien de la combinación de los cromosomas parentales o mediante el entrecruzamiento de cromosomas homólogos.

B.- Recombinación parasexual

Algunos de los hongos económicamente útiles como Penicillium chrysogenum (productor de penicilina) y Cephalosporium acremonium (productor de cefalosporina) no tienen ciclo sexual. En la parasexualidad, la fusión de dos hifas de igual o de diferente polaridad resulta en un micelio con núcleos de ambas cepas parentales. Este
heterocarionte es normalmente estable, con los núcleos mezclados pero no interaccionan. Sin embargo, en casos raros (10-7-10-6 en Penicillium chrysogenum) se produce la fusión nuclear y se forma un núcleo diploide. En tales núcleos diploides puede producirse el entrecruzamiento entre cromosomas homólogos, lo que origina la recombinación genética. Para obtener un recombinante debe producirse la formación de células haploides o esporas. La haploidización espontánea es relativamente rara (10-3) pero puede ser inducida con p-fluorofenilalanina.




V. FUSION DE PROTOPLASTOS


Los protoplastos son células de las que se ha eliminado la pared celular por tratamiento con enzimas. Para las bacterias se utiliza la lisozima, mientras que para hongos se utiliza quitinasa o celulasas. Los protoplastos deben ser estabilizados contra la lisis por resuspensión en un medio que contenga un estabilizador osmótico como la sacarosa. La fusión de protoplastos normalmente es rara debido a la fuerte carga negativa de la superficie del protoplasto, pero en presencia de polietilenglicol (PEG) los protoplastos se agregan y se produce la fusión acompañada por intercambio de DNA. Después de la fusión se permite la regeneración de la pared celular de tal manera que en la progenie regenerada exista un número significativo de recombinantes.

También se puede inducir la fusión mediante la aplicación de un campo eléctrico lo que se denomina
electrofusión. Cuando las células son colocadas en un campo eléctrico con corriente alterna se desarrollan orificios pasajeros en la membrana plasmática, lo que facilita el proceso de fusión de membranas y la fusión celular. La velocidad de fusión es de aproximadamente el 80-90%, más alta que el 60% obtenido con PEG. Además de su uso en la fusión de protoplastos de plantas, la electrofusión puede ser también utilizada con protoplastos de levaduras y hongos. Sin embargo, la fusión de los pequeños protoplastos bacterianos es más difícil de conseguir.

La fusión de protoplastos se utiliza con los siguientes fines:

a.- Recombinación intraespecífica de cepas que carecen de sistema sexual o parasexual, o cuya frecuencia de recombinación es demasiado baja.

b.- Hibridación interespecífica para obtener organismos completamente nuevos capaces de sintetizar metabolitos modificados. El uso de la fusión de protoplastos para este objetivo está siendo examinado por diferentes productores de antibióticos. Entre los hongos se han intentado cruces interespecíficos entre varios obteniéndose recombinantes en el cruce entre Penicillium cyaneofulvum X Penicillium citrimum aunque con una frecuencia muy baja (10-5). La baja frecuencia de fusión heteroespecífica puede ser debida a que la falta de homología del genoma impide que tenga lugar la recombinación o bien a la presencia de sistemas de restricción/modificación que llevan a la incompatibilidad fisiológica.




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