TEMA 15: PRODUCCION DE ANTIBIOTICOS

Dr. Pedro F. Mateos

I. INTRODUCCION

Los antibióticos son productos del metabolismo microbiano que son capaces de matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos a bajas concentraciones.

Durante la II Guerra Mundial la demanda de agentes quimioterapéuticos para tratar las infecciones de las heridas condujo al desarrollo de un proceso de producción para la penicilina y al inicio de la era de investigación sobre los antibióticos. En la actualidad continua siendo una de las áreas más importante de investigación dentro de la Microbiología Industrial.

El número de antibióticos descritos continúa aumentando debido a los programas intensivos de búsqueda en todos los países industriales. En 1961 eran conocidos 513 antibióticos, 4076 en 1972, 7650 en 1985 y en 1990 alrededor de 8000. Cada año se detectan aproximadamente 300 nuevas sustancias con actividad antibiótica, de las que el 30-35% son componentes secundarios de las fermentaciones de antibióticos conocidos. Del gran número de antibióticos conocidos de origen microbiano, solamente 123 se producían por fermentación en 1984. Además, más de 50 antibióticos se producían como compuestos semisintéticos y 3 antibióticos (cloranfenicol, fosfomicina y pirrolnitrina) se producen en forma completamente sintética.

Los antibióticos son producidos por bacterias y hongos. Entre los hongos, solamente 10 de los antibióticos conocidos se producen comercialmente y solamente las penicilinas, cefalosporina C, griseofulvina y ácido fusídico tienen importancia clínica. En las bacterias existen muchos grupos taxonómicos que producen antibióticos. La mayor variedad en estructura y número de antibióticos se encuentra en los actinomicetos, especialmente en el género Streptomyces.

La producción mundial de antibióticos en 1979 estaba por encima de las 100.000 toneladas por año. Las ventas brutas anuales, sólo en USA, eran de 1000 millones de dólares, con la cefalosporina en la posición de cabeza, seguida de la ampicilina y las tetraciclinas.

Antes de 1960 aproximadamente el 5% de los antibióticos recientemente aislados eran útiles terapéuticamente. En los años siguientes fueron descubiertos nuevos antibióticos a una velocidad aproximadamente constante, pero el porcentaje de los nuevos antibióticos que realmente llegaban al mercado descendió desde el 2,6% entre 1961-1965 al 1% entre 1966-1971. Esto se debe fundamentalmente a un aumento severo en los costes del desarrollo y de las pruebas clínicas, de forma que muchos fabricantes producen solamente aquellos compuestos que claramente muestran un progreso terapéutico prometedor. Por término medio se necesitan alrededor de 8-10 años para desarrollar un nuevo antibiótico a un coste medio de 10x10⁶ - 20x10⁶ dólares (2500 millones de pesetas; 15 millones de euros).

La obtención de mejores antibióticos se lleva a cabo por modificación de los compuestos conocidos utilizando medios químicos o genéticos (mutasíntesis, fusión de protoplastos, tecnología del DNA recombinante). Sin embargo, solamente por procesos de Screening pueden esperarse encontrar antibióticos con estructuras básicas enteramente nuevas, especialmente por la utilización de nuevos procedimientos de prueba y por la investigación en nuevos grupos de microorganismos.

II. PRODUCCION DE PENICILINAS

Los antibióticos ß-lactámicos se caracterizan por poseer en su estructura el anillo ß-lactámico que está compuesto por 3 átomos de carbono y 1 átomo de nitrógeno. Los antibióticos ß-lactámicos se pueden dividir en cinco clases diferentes:

· Penicilinas
· Clavamas
· Cefalosporinas
· Monobactamas
· Carbapenemas

Las penicilinas y cefalosporinas pertenecen a los más efectivos de todos los agentes terapéuticos usados en el control de las enfermedades infecciosas.

La penicilina fue descrita por Fleming en 1929. Un grupo de investigación en Oxford, bajo la dirección de Florey y Chain, la aisló a partir de cultivos de Penicillium notatum en 1940 y la primera aplicación clínica de la penicilina se realizó en 1941. Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de Penicillium y Aspergillus.

Las penicilinas naturales son efectivas contra numerosas bacterias Gram +. Son lábiles en medio ácido y pueden ser inactivadas por hidrólisis del anillo ß-lactámico con penicilinasas. Debido a su baja toxicidad pueden ser utilizadas grandes dosis de penicilina, solamente un pequeño porcentaje de pacientes desarrollan alergia (0,5-2%).

Los antibióticos ß-lactámicos son inhibidores específicos de la síntesis de peptidoglicano, componente de la pared celular bacteriana. Son análogos estructurales de la D-alanil-D-alanina y por ello se considera que estos fármacos se unen a las transpeptidasas a las que inactivan irreversiblemente. Algunas penicilinas son menos efectivas frente a Bacterias G - debido a que la membrana externa bloquea su paso al interior, aunque las penicilinas sintéticas y cefalosporinas tienen efecto también frente a Bacterias G -.

1.- Estructura química

La estructura básica de las penicilinas es el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), que consiste en un anillo tiazolidínico con un anillo ß-lactámico condensado. El 6-APA lleva una parte variable acilada en la posición 6.

Si la fermentación de penicilina se lleva a cabo sin adición de precursores de la cadena lateral se producen las penicilinas naturales. A partir de esta mezcla solamente es útil terapéuticamente la bencilpenicilina; los otros compuestos deben ser eliminados durante la etapa de recuperación del producto. La fermentación puede ser controlada mejor añadiendo un precursor de la cadena lateral, de forma que solamente se produzca una penicilina deseada. Más de 100 penicilinas biosintéticas han sido producidas de esta forma. En los procesos comerciales, sin embargo, solamente han sido producidas la penicilina G y la penicilina V, y cantidades muy limitadas de penicilina O. Utilizando el ácido fenoxiacético, como precursor de la cadena lateral, se consiguió la obtención de penicilina V (fenoximetilpenicilina), penicilina que es particularmente estable en medio ácido y que puede, por tanto, suministrarse por vía oral al contrario de lo que ocurre con la penicilina G ya que debido a su sensibilidad a los ácidos no se puede administrar oralmente puesto que es hidrolizada en el estómago.

A diferencia de las anteriores, las penicilinas semisintéticas incluyen diversas penicilinas obtenidas al añadir químicamente una gran variedad de cadenas laterales al ácido 6-APA. Penicillium chrysogenum puede sintetizar este ácido si el medio de cultivo carece de precursores de la cadena lateral. Sin embargo, la producción de 6-APA en estas condiciones es tan pequeña que hace inviable este procedimiento. La deacilación química tampoco es rentable pues este proceso comprende tres etapas que deben llevarse a cabo a baja temperatura y en condiciones anhidras estrictas, requiriéndose además varios solventes químicos. Por estas razones, la producción industrial del 6-APA necesario para la fabricación de penicilinas semisintéticas se realiza por deacilación enzimática de la penicilina G. Este proceso biológico se basa en la producción por ciertas bacterias de acilasas que eliminan el grupo bencilo. La deacilación se realiza en H₂O a 37°C, lo que reduce considerablemente los costes. Después de la deacilación se obtiene una solución de sales sódicas del ácido fenilacético y 6-APA. El fenilacético recuperado se puede utilizar posteriormente para la producción de penicilina G. Debido a sus mejores características (estabilidad a la acidez, resistencia a ß-lactamasas, mayor espectro antimicrobiano), las penicilinas semisintéticas han llegado a ser extensamente utilizadas en terapia.

Aproximadamente el 38% de las penicilinas naturales producidas comercialmente se utilizan en medicina humana, el 12% en veterinaria y el 43% como material de partida para la producción de penicilinas semisintéticas.

2.- Biosíntesis y regulación

El anillo ß-lactámico-tiazolidínico de la penicilina se produce a partir de L-cisteína y L-valina. La biosíntesis se produce por medio de un dipéptido compuesto de ácido L-a-aminoadípico (L-a-AAA) y L-cisteína. Subsecuentemente se conecta la L-valina mediante una reacción de epimerización, dando lugar a la formación del tripéptido d-(L-a-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina. El primer producto de la ciclación del tripéptido que puede ser aislado es la isopenicilina N, pero no se conocen las reacciones bioquímicas que conducen a este intermediario. La bencilpenicilina se produce en el intercambio de L-a-AAA (L-a-aminoadípico) con ácido fenilacético activado. El 6-APA, que no es un producto intermediario de biosíntesis, se excreta en ausencia de un precursor de la cadena lateral.

Se conocen varios mecanismos reguladores en la biosíntesis de la penicilina. El aminoácido lisina es sintetizado a partir de la vía que origina el ácido L-a-aminoadípico de forma que la penicilina y la lisina comparten una ruta biosintética ramificada común. La lisina inhibe la síntesis de penicilina debido a que inhibe por retroalimentación a la homocitrato sintasa, un enzima implicado en la síntesis de L-a-AAA. Si el L-a-AAA es deficiente, no puede sintetizarse penicilina. Sin embargo, la retrorregulación por lisina no parece ser una etapa limitante en la biosíntesis de penicilina. La biosíntesis de penicilina se ve afectada por la concentración de fosfato y también muestra una clara represión catabólica, particularmente por glucosa.

3.- Desarrollo de cepas

La producción de penicilina por la cepa aislada por Fleming era de aproximadamente 2 u.i./ml; los procesos actuales producen un título de penicilina de aproximadamente 85.000 u.i./ml. Este es un aumento desde 0,0012 g/l hasta 50 g/l e ilustra bien el valor y el poder de un programa de selección de cepas.

La mejora del cultivo inicial se produjo en 1943 con el aislamiento de la cepa Penicillium chrysogenum NRRL1951. Este microorganismo era más adecuado para la producción en cultivo sumergido que la cepa original, Penicillium notatum. Mediante posterior mutagénesis fué aislada la cepa WisQ176, la cepa original de la línea de cultivos Wisconsin. WisQ176 fué adoptada por la mayor parte de los fabricantes de penicilina y fué utilizada como cepa original en los distintos programas comerciales de mejora de cepas, acerca de los que se ha publicado poco (secreto industrial). Si bien los aumentos de rendimiento han sido el objetivo principal del desarrollo de las cepas, también han sido optimizados otros factores que tienen un efecto sobre la fermentación y la eficiencia de recuperación del producto.

Los principales avances en el procesamiento han sido obtenidos a través del screening empírico de mutantes. Hasta mitad de los años 60 los mutágenos utilizados más frecuentemente eran los rayos X, mostaza nitrogenada y radiaciones de longitud de onda corta. Más recientemente han sido utilizados como mutágenos la nitrosoguanidina, los agentes alquilantes y los nitritos. A principios de los 70 la mejora de cepas por el mero uso de la mutación había alcanzado su límite. El descubrimiento de un ciclo parasexual en Penicillium chrysogenum proporcionó una forma de utilizar la recombinación genética para el desarrollo de cepas. Se describieron diploides heterozigóticos que tenían títulos de penicilina superiores a los de las cepas haploides parentales. Sin embargo, el mayor porcentaje de cepas con producción superior de penicilina se produjo a partir de los haploides segregantes de los cruces entre mutantes de diferentes líneas. La técnica de fusión de protoplastos abrió un nuevo enfoque en el desarrollo de cepas de alta producción obteniéndose rendimientos del 8% superiores a los obtenidos por mutación y selección. Además, algunas de las cepas resultantes han tenido mejores características de crecimiento, como esporulación más estable y mejor crecimiento para la producción del inóculo. El uso de la ingeniería genética para aumentar la síntesis de enzimas que catalizan pasos limitantes, mediante la amplificación génica o mejora de la transcripción, no ha sido todavía posible en Penicillium chrysogenum debido a la ausencia de datos biosintéticos precisos y a la ausencia de buenos sistemas vector-hospedador. Sin embargo, se ha construido un banco de genes para Penicillium chrysogenum y se ha desarrollado un sistema de transformación.

4.- Métodos de producción

La penicilina G y la penicilina V son producidas utilizando procesos sumergidos en fermentadores de 40.000-200.000 litros. Debido a las dificultades en el suministro de oxígeno no pueden ser empleados tanques mayores. La fermentación de penicilina es un proceso aeróbico con una velocidad de absorción volumétrica de oxígeno de 0,4-0,8 mM/l min. La velocidad de aireación requerida está entre 0,5-1,0 vvm dependiendo de la cepa, del biorreactor y del tipo de impulsor. Para el mezclado se suelen utilizar varios impulsores de tipo turbina (120-150 rpm). El rango de temperatura óptima es de 25-27°C.

Un esquema típico de producción de penicilina se muestra en la figura. El inóculo se inicia utilizando esporas liofilizadas. Debido a la gran variabilidad de las cepas de alta producción, es necesario el mantenimiento cuidadoso de las cepas. La concentración de esporas (óptima 5x103/ ml) y la formación de agregados son cruciales para el rendimiento subsecuente. Si se quiere conseguir una velocidad óptima de formación de penicilina, los agregados (pellets) no deben crecer como bolas compactas sino de una forma suelta.

Después de varias etapas de crecimiento está preparado el cultivo de producción. En la fermentación típica de penicilina existe una fase de crecimiento de c.a. 40h con un tiempo de duplicación de 6h, durante la cual se forma la mayor parte de la masa celular. El suministro de oxígeno es crítico en el cultivo en crecimiento ya que el aumento de la viscosidad dificulta la transferencia de oxígeno. Después de la fase de crecimiento, el cultivo llega a la fase real de producción de penicilina. Debido al aporte de distintos componentes al medio, la fase de producción puede extenderse hasta 120-160h.

El medio de un cultivo típico alimentado puede variar dependiendo de la cepa, y generalmente consiste en:

· Líquido de maceración de maiz (4-5% peso seco).
· Una fuente de Nitrógeno adicional, harina de soja, extracto de levadura o suero.
· Una fuente de carbono, lactosa.
· Varios tampones
· El pH se mantiene constante a 6,5.
· El ácido fenilacético o el fenoxiacético se alimentan continuamente como precursores (0,5-0,8% del total).

Los procesos con alimentación de glucosa o melazas también tienen éxito. En estos casos las velocidades de alimentación son de 1.0-2.5 kg*m^-3*h^-1, con una concentración de glucosa de 500 kg*m^-3.

Aproximadamente el 65% de la fuente de carbono metabolizada se utiliza para el mantenimiento energético, el 25% para el crecimiento y sólo el 10% para la producción de penicilina.

Se ha intentado la producción de penicilina por fermentación continua, pero ha sido difícil debido a la inestabilidad de las cepas de producción. Como alternativa se ha sugerido un sistema de "tanque de llenar y sacar". En este procedimiento el 20-40% del contenido de la fermentación se saca y se reemplaza con solución fresca de nutrientes; este proceso puede ser repetido hasta diez veces sin reducción del rendimiento.

Se está llevando a cabo una intensa investigación para producir penicilina con células inmovilizadas. En un estudio a escala de laboratorio se demostró la ventaja de este enfoque sobre el uso de sistemas discontinuos alimentados, pero esta técnica no ha sido introducida todavía a nivel comercial.

La penicilina es excretada al medio y menos del 1% permanece unida al micelio. Después de la separación del micelio, la recuperación del producto se lleva a cabo por medio de dos etapas de extracción continua en contracorriente del caldo de fermentación con acetato de amilo o de butilo a 0-3°C y pH: 2,5-3,0. El rendimiento es de alrededor del 90%.